线粒体DNA提取试剂盒

级别：	分析纯AR	用途：	实验室
含量：	对照品	应用：	科学研究
产量：	20

三，说明线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞线粒体DNA的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。四，操作步骤准备工作：在DNA酶I中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反应液，适当分装后-20度保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。1. 样本处理a. 组织匀浆：称取100~200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0mL冰预冷的LysisBuffer，0℃冰浴上下研磨组织20次；b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800×g5~10min离心收集细胞。计数。每次提取需要5×107个细胞，加入1.0mL冰预冷的LysisBuffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次；2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000×g 离心5min；3. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000×g 再次离心5min。4．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000×g 离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；5. 在线粒体沉淀中加入0.5mL WashBuffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g 离心5min；6．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000×g 离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；7. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10ulDNA酶I溶液（见准备工作），混匀，37度水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃， 12,000×g 离心5min。尽可能的弃上清，再加入200ulTE 重悬线粒体沉淀，离心，洗去残留的DNA酶。8.得到的沉淀，用100ulTE 重悬线粒体沉淀。加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置2min左右，不超过5min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃， 12,000×g 离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。9．取上清，加入一新的离心管中（可选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可省，并不影响后续的PCR），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA）及10ul核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃， 12,000×g 离心10min。10. 弃上清，再加入1ml  70%乙醇，4℃， 12,000×g 离心10min。重复用70%乙醇洗一次。11. 弃上清后再次离心1min 吸弃上清，开盖凉干约5-10分钟。12．加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底，37度水浴5分钟，线粒体DNA溶解。13. 进行DNA电泳检测及-20度保存，进行下步的实验。四注意事项：1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。2．线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。